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einstein. 2004; 39 139 revolucionado a prática da patologia, anatomia e análises clinicas. As técnicas moleculares são agora aplicáveis a todas as áreas do laboratório clínico. Na anatomia patológlca, apesar das análises morfológicas ainda serem a principal ferramenta de trabalho, resultados dos estudos de genética molecular têm integrado, cada vez mais, os diagnósticos nas análises cirúrgicas(3-5). Os estudos genéticos moleculares utilizam uma variedade de técnicas para analisar os ácidos nucléicos (DNA e RNA).

Dentre estas técnicas destacam-se: técnica de hibridiza Northern, e hibridiza e alvos-específicos PCR-transcriptase re tempo-real; métodos org to uthern e mplificação titiva, l, como por exemplo branched DNA (bDNA); tecnologia de arrays. Os resultados destes ensaios podem ser úteis no diagnóstico, prognóstico, determinação da terapia a ser utilizada, e até mesmo na avaliação da suscetibilidade a doenças. As principais áreas de aplicação das técnicas moleculares de diagnóstico são: doenças infecciosas, câncer, doenças genéticas, transplantes e patologia clínica(4-8).

Estes estudos podem ser realizados no sangue periférico, fluidos corporais, materiais obtidos através de unção, tecidos frescos e tecidos embebidos em parafina. Na área de doenças infecciosas, a detecção rápida de microrganismos de crescimento lento, ou daqueles não cultiváveis, se torna possível através das técnicas de biologia molecular. A As técnicas moleculares também podem ser empregadas na determinação de resistência antimicrobiana, no monitoramento de doenças através da quantificação da infecção e em estudos epidemiológicos(4).

Na área de genética humana, a biologia molecular tornou se ferramenta fundamental no diagnóstico das doenças monogênicas, permitindo não só a identificação o gene afetado, mas também da mutação responsável pela doença. A disponibilidade dos métodos diagnósticos tem possibilitado também a identificação de portadores heterozigotos, o diagnóstico pré-natal e a triagem populacional para estas doenças.

Embora a maioria dos testes genéticos ainda se destine ao diagnóstico e prevenção de doenças raras, os avanços tecnológicos têm permitido o uso destes testes para a avaliação de risco de doenças como câncer e doenças cardiovasculares(g-11 A correlação entre mutações gênicas e suscetibilidade a doenças é particularmente importante no câncer, sendo que cerca e 5% a 10% do casos ocorrem em indivíduos que herdaram alguma predisposição a essa doença.

Dentre Revendo Ciências Básicas O objetivo desta subseção é apresentar revisões concisas sobre temas relacionados com as ciências básicas, ou seja, procurar rever as bases da prática médica. A justificativa para a inclusão de tópicos dessa natureza relaciona-se com os significativos progressos dessas ciências nas últimas décadas e à necessidade absoluta de atualização por parte da equipe de saúde, para o benefício dos pacientes.

Magda M. S. Carneiro-Sampaio Edltora Associada da einstein Série – Biologia molecular Atualização Parte 2 – Uso das técnicas de biologia molecular para diagnóstico PAGFarl(Fq Biologia molecular Adriana Lopes Molina 1, Patrícia Renovato Tob02 1 Pesquisadoras do Centro de Pesquisa Experimental do Instituto de Ensino e Pesquisa do Hospital Israelita Albert Einstein – São Paulo (SP). Pesquisadoras do Centro de Pesquisa Experimental do Instituto As técnicas hoje utilizadas na genética molecular têm sido desenvolvidas a partir da pesquisa acadêmica básica, em diferentes campos da atividade científica(l O trabalho de Watson e Crick, em 1953, onde foi proposta a estrutura e dupla-fita do DNA, marcou a revolução molecular. Em 1975, Nathans e Smith purificaram enzimas de restrição, ferramentas essenciais para a manipulação in vitro do DNA.

Estas foram de fundamental importância para o isolamento e amplificação de fragmentos específicos de DNA para a clonagem in vivo, tecnologia desenvolvida a partir das técnicas de DNA recombinante descritas por Berg em 1972. Também em 1975 uma nova metodologia, denominada Southern blotting, começou a ser usada para investigar a localização de genes e marcou o início da aplicação destas tecnologias no estudo das doenças genéticas. Em 1977, técnicas de seqüenciamento permitiram a identificação de alterações especificas na sequência de DNA e a associação destas com diferentes doenças genéticas.

Depois disso, o pnncpal marco no desenvolvimento das técnicas de diagnóstico molecular foi a técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR), um método de clonagem in vitro proposto por Kary Mullis em 1987. Desde a intro PAGF3rl(Fq polimerase (PCR), um método de clonagem Desde a introdução da técnica de PCR, rápidos avanços nas técnicas de genética molecular têm einstein. 2004; 140 os genes mais estudados de predisposição ao câncer stão o BRCAI e BRCA2, nos cânceres de mama e ovário hereditários e os genes de reparo do DNA, MLHI e MSH2, para os tumores colorretais.

Assim, entre as diversas possibilidades de aplicações da biologia molecular no diagnóstico, os testes moleculares mais comumente empregados são: os de avaliação de carga viral para HIV e hepatite C, testes para trombofilia hereditária, testes para mutações genéticas nos casos de câncer familial, hibridização in situ fluorescente (FISH) para estudos das trissomias mais comuns no líquido amniótico, para a amplificação do gene HER-2 em câncer e mama, além de numerosos testes genéticos disponíveis para a avaliação de doenças hematológicas.

Técnicas de amplificação do sinal (hibridização) Esta tecnologia, introduzida primeiramente por Southern em 1975, emprega sondas de DNA com homologia à seqüência do DNA-alvo em estudo. Atualmente, apesar da disponibilidade de diversas outras técnicas mais rápidas, o Southern blotting continua a ser muito utilizado. As sondas de DNA podem ser usadas para identificar sequências especificas de DNA ou RNA em diversas amostras, sendo empregadas tanto em ensaios de detecção como de atividade.

As sondas podem ser marcadas com radioatividade ou com quimiofluorescência. Uma vez hibridizada à amostra de DNA, que está imobilizada numa membrana de nitrocelulose ou nylon, a sonda poderá ser detectada or expos imobilizada numa membrana de nitrocelulose ou nylon, a sonda poderá ser detectada por exposição a um filme de raio X. Mais recentemente, em 1995, fol Introduzida por Schena e colaboradores outra tecnologia baseada na amplificação de sinal, a tecnologia de microarrays.

São lâminas com uma alta densidade de sequências de DNA que permitem estudos de níveis de expressão gênica, nalisando-se uma grande quantidade de genes ao mesmo tempo, utilizando sondas de cDNA. Reação em cadeia da polimerase (PCR) A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma das técnicas mais empregadas nas diversas áreas do diagnóstico molecular. A sua introdução resultou em grande revolução tecnológica, permitindo a amplificação de uma sequência de interesse contida em uma amostra complexa de DNA e possibilitou a adoção de métodos automatizados para a análise do genoma.

A tecnologia da reação em cadeia da polimerase também é bastante flex(vel, permitindo uma érie de modificações que possibilitam o seu emprego na análise de uma grande variedade de amostras. Para a realização da PCR, utiliza-se uma enzima termoestável (DNA polimerase) que, na presença de um par de oligonucleotídeos iniciadores (primers) e dos nucleotídeos que compõem a molécula de DNA, amplifica a região de interesse a partir de uma pequena quantidade de DNA.

Esta amplificação ocorre durante repetidos ciclos de temperatura, a saber: 940C para desnaturação do DNA, 450C a 700C para hibridização dos oligonucleotideos às sequências-alvo e 720C para a síntese do DNA, em equipamentos chamados de ermocicladores. O DNA amplificado pode, então, ser separado e visualizado em géis de agaros separado e visualizado em géis de agarose ou poliacrilamida e utilizado para diversos fins (figura 1). Entre as principais técnicas resultantes de modificações da reação em cadeia da polimerase, podemos citar o RT-PCR, nested PCR, multiplex PCR, PCR a partir de primers randômicos e PCR em tempo real.

O RT-PCR utiliza uma enzima chamada transcriptase reversa para converter uma amostra de RNA em cDNA antes da etapa de amplificação por PCR, permitindo estudo de v(rus de RNA e análises de expressão gênica. O nested PCR, que emprega uma segunda etapa de amplificação com um par de primers Figura 1 . Esquema representativo da reação da PCR einstein- 2004; 141 internos aos utilizados na primeira etapa e visa aumentar a sensibilidade e especificidade do método. Já PCR multiplex é uma reação de amplificação desenhada para detectar múltiplas sequências-alvo numa mesma amostra.

PCR a partir de primers randômicos utiliza sequências curtas de oligonucleotideos para amplificar regiões repetitivas do DNA genômico e é bastante empregado em estudos epidemiológicos. Finalmente, PCR em tempo real permite que a mplificação e a detecção ocorram simultaneamente, num sistema fechado, sendo necessário para isto um termociclador que possua sistema de monitoramento de emissão de fluorescência. Esta técnica é empregada para quantificação de amostras, como para testes de carga viral e monitoramento de doença residual mínima.

Técnicas de detecção de mutações em genes conhecidos Existem diversas técnicas para detecção de mutações em genes conhecidos, sendo o sequenciamento o go PAGFsrl(Fq detecção de mutações em genes conhecidos, sendo o sequenciamento o gold standard. Ele é o método com maior nível de resolução, permitindo nalisar cada uma das bases de determinada sequência de DNA. Atualmente, as técnicas de escrutínio de mutações têm, cada vez mais, sensibilidade e especificidade para detectar alterações de uma única base na sequência de DNA.

Uma vez identificada a região do gene que contém uma alteração, esta será confirmada pela técnica de sequenciamento. Existem várias técnicas descritas para escrutínio de mutações de ponto em fragmentos de DNA que utilizam a técnica da PCR. Algumas destas técnicas baseiam-se nas diferenças de mobilidade eletroforética de fragmentos com seqüências de DNA selvagens e utantes: – DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis); — SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism); – HA (Heteroduplex Analysis); – CSGE (Conformation Sensitive Gel Electrophoresis).

Existem ainda outras técnicas que se baseiam na clivagem de bases não pareadas em heteroduplexes: (CCM – Chemical Cleavage Method e EMC – Enzyme Mismatch Cleavage), ou utilizam a detecção de alterações na proteína transcrita por um determinado fragmento de DNA (PTT Protein T uncation Test). Uma das técnicas mais empregadas é o SSCP e o HA. A técnica de SSCP baseia-se no fato de que a onformação tridimensional de fragmentos de DNA simples-fita depende da seqüência de nucleotídeos, sendo que a diferença de um nucleotídeo altera o padrão de migração eletroforética.

Por sua vez, a técnica de HA baseia-se no fato de que se numa reação de PCR estiverem presentes moléculas de DNA selvagens e mutantes, durante os últimos reação de PCR mutantes, durante os ultimos ciclos poderão se formar heteroduplexes entre essas duas especies de moléculas e que estes terão um padrão de migração eletroforética diferente dos homoduplexes (figuras 2 e 3). Atualmente, outra técnica que tem sido empregada a análise de heteroduplexes é a DHPLC (Denaturing high-performance liquid chromatography).

O escrutínio de mutações através da DHPLC baseia-se na diferença de afinidade dos heteroduplexes e homoduplexes, de um determinado fragmento amplificado de DNA, pela Figura 2. Esquema do método de SSCP, mostrando que diferentes seqüências podem apresentar conformações especificas possibilitando a identificação de diferentes alelos quando submetidos a uma corrida eletroforética Figura 3. Esquema representativo da análise de heteroduplexes. ) Produtos de PCR referentes aos dois alelos de um indivíduo heterozigoto (+/-) ara uma mutação ponto Após a denaturação e renaturação dos produtos de PCR, moléculas homoduplexes (azuis) e heteroduplexes (rosas) são formadas. b) Os heteroduplexes tendem a migrar mais em um gel de poliacrilamida (banda superior) do que as homoduplexes (inferior) einsten. 2004; 142 Figura 4. Cromatograma representativo da análise de heteroduplexes por dHPLC fase sólida da cromatografia, em condições parcialmente denaturantes.

Esta técnica tem sensibilidade e especificidade estimada e 0% e tem sido mostrando-se mais eficiente do que outras técnicas rotineiramente utilizadas para este fim. Além da alta sensibilidade na detecção de mutações, esta técnica permite um alto grau de automação e não requer nenhum tratamento especial ao produto de PCR. Desta forma, facilita a análise de um grande número de amostras, bem como de genes com vários éxons (figura 4).

Referências 1 . Atkins SD & Clark ‘M. Fungal molecular diagnostics: a min review. J App Genet. 5. 2. Boxer M. Molecular techniques: divide or share. J Clin pathol. 3. Cotton RGH. Slowly but surely towards better scanning for mutations. TIG. 1997; 4. Linscott AJ. Molecular diagnostics for infections disease. Pathol Case Rev. 5. Moreira-Filho CA. Medicina genômica e prática clínica. Genômca. São Paulo: Atheneu; 2004. p. 195-206. 6.

Nardi NB- Doenças genéticas: gênicas, cromossômicas, complexas. Genômica. São Paulo: Atheneu; 2004 p. 211-25. 7. Offit K Clinical cancer genetics: risk counseling and management. New York: Wiley-Liss; 1998. 8. Passos-Bueno MRS, Moreira, ES. Ferramentas básicas da genética molecular humana. Genômica. São Paulo: Atheneu; 2004. p. 43-67. 9. Spiegelman JI, Mindrinos MN, Oefner High-accuracy DNA sequence variation screening by DHPLC. Biotechniques. 1084-92. AIGFgrl(Fq