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tese . . . 2 3 1. ÍNDICE pagina Apresentação da 014 Capítulo 01 – Revisão bibliográfica…………… 016 capítulo 02 Débora – SiRNA…. 051 alfa… 075 093 8 p o de moléculas de Capitulo 03 – Programa strand analysis, versão Capítulo 04 – Programa strand analysis, versão beta….. — Capítulo 05 Small interfering RNAs (siRNAs) reduce worm burden neurotrófico derivado do cérebro CAP: sete-metil-guanosina trifosfato proteção do mRNA na porção 5 CBAB: Centro Brasileiro-Argentino de Biotecnologia CDS (conding sequence): sequência codificadora CNS (central nervous system): sistema neruoso central

CpG (cytosine phosphate guanosine): citosina (seguida em uma mesma fita) de uma guanosina cRNA (complementar RNA):RNA complementar DCL (dicer-like): proteínas relacionadas à dicer DNMT: DNA metiltransferase dsRNA (double-stranded RNA): RNA dupla fita ECA (=ACE) : enzima conversora de angiotensina eri (enhanced RNA interference): mutante com resposta intensificada para RNAi EST (expressed sequence tags): fragmentos de sequências expressas FAK (focal adhesion kinase): quinase de adesão focal FOREST : Brazilian Eucalyptus Genome Sequence Project: projeto brasileiro de sequenciamento o genoma do eucalipto.

GFP (green fluorescent protein): proteína verde fluorescente GMP (guanosine monophosphate): monofosfato de guanosina HC-Pro: helper-component proteinase HCV: Hepatitis c virus Hg: mercúrio HGPRTase: hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase 6 HIV: Human immunodeficiency virus IMP (inosine monophosphate) : monofosfato de inosina VT (in vitro transcription): transcrição in Vitro Kb (kilobase): quilobase Kcal: (kilocalorie) quilocaloria LNA: locked nucleic acid (t g8 rente à modificação de DNA): silenciamento meiótico induzido por DNA não pareado ng: nanograma m: nanômetro nmol: nanomoles nt: nucleotideo ORF (open reading frame): fase aberta de leitura Pág. página PAZ domain: domínio PIWI, Argonauta, Zwille pb: par de base PBS (phosphate buffer saline): tampão fosfato salino PCR (polymerase chain reaction) : reação em cadeia da polimerase PKR: proteína kinase R PTGS (posttranscrptional gene silencing): silenciamento gênico pós-transcricional PVX (potato virus x): v[rus x da batata 7 PVY (potato virus y): vírus y da batata RDE (RNAI defective): gene que quando mutado torna o organismo defectivo em RdRP (RNA-dependent RNA polymerase): RNA polimerase ependente de RNA rgs-CaM (regulator of gene silencing – calmodulin-related): regulador do silenciamento gênico similar à calmodulina RIP (Repeat-induced point mutation): mutação de ponto induzida por repetição RISC (RNA-induced silencing complex): complexo de silenciamento induzido por RNA RITS (RNA-induced initiation of transcriptional gene silencing): (complexo) de silenciamento gênico transcricional induzido por RNA. RNAi (RNA interference): interferência or RNA RT (reverse transcriptase): versa transcrição TCID (tissue culture infectious doses) : doses infecciosas de cultura de tecido

TGS (transcriptional gene silencing): silenciamento gênico transcricional Tm (temperature of melting): temperatura de fusão U TR (untranslated region): região não traduzida XMP (xanthine monophosphate): monofosfato de xantina 8 Agradecimentos A Deus por me conceder vida por me dar a chance de estudar a vida por me fazer feliz nesta vida e por me conceder a vida eterna. À minha família meus pais, sempre presentes em cada momento dessa longa caminhada, pelo suporte incondicional em todos os campos da minha vida. À minhas irmãs Débora e Patrícia, meus cunhados Valdir e Tarciso e sobrinhos Ester e Israel por ompletarem minha Vida. Aos amigos do RNAi Patrícia Aline, pela sua imensa disposição em me ajudar em todos os momentos, Vínicius D. B.

Pascoal, pela sua amizade, versatilidade e capacidade, Mariana pelas inúmeras ajudas nos RT-PCRs da vida e por sua alegria Inata, Danyella Dogini pela amizade e auxílio no laboratório ( Quem é que ta falando aí ?? ) Mariângela Grippo pela ai os com proteínas e 4 Veimar (amigo de graça), Pr. Edilson, Iara, Beatriz, Pr. Gerson, Juçara, Pr. Cláudio e Dalma, Marcos (-covisk), Pr. Maurilo, Rita, Estevão, Thomaz, Eduardo (Du), Rodrigo Dgão – El matador), Jogracias, Ivan (my English teacher), Virgínia, Risia, Edinho, Júnior, Daniel Leite (Maná), Daniel de Ipatinga, Brenda, Hugo (-zmento), Bruno (with lasers), Fabrício (José), Esdras (neemias), Poliano e Vanessa (casados!! ), Alessandro e Érika, Luciana e Fábio, Assenir, Akira, Teresa.

Celso, Cris, Patrícia Sakakura, comissão de louvor e tantos outros… Aos revisores desta tese, membros da pré-banca Prof. Dr. Gonçalo Guimarães Pereira, Dpto de Genética, Unicamp, Prof. Dr. Murilo Zerbinl, Dpto de Fitopatologia, UFV, MG Profa. Dra. Zilá Luz Paulino Simões, Opto de Genética, FMRP USP, Aos inumeros colaboradores diretos e indiretos À FAPESP Por conceder a bolsa de estudos de doutorado por todo o período de trabalho (processo número 02/01 828-8). 10 o passado que é presente… Ao Prof. Dr. Ivan de Godoy Maia, “Fio”, gostaria dizer que gosto muito de você! Você me ajudou demais em todos !!! Com toda , tranqüilidade, esses anos….. s OF pergunta: “Onde você aprendeu a fazer isto? eu respondo: “Vide – Maia IG, 1998-presente” Você e a adorável Jaqueline conquistaram um amigo para sempre. Em todo tempo ama o amigo, e na angústia se faz o irmão. Provérbios, 17:1 7 11 presente ambíguo… À Profa. Dra. Iscia Lopes-Cendes, A senhora foi um presente de Deus para mim, e disso não tenho dúvidas. A forma como nos entendemos e trabalhamos prova-me claramente que nossas vidas se encontraram para eu ter chance de crescer sob sua supervisão – isso é Obra divina. Surpreendo-me diante de sua brilhante carreira sendo ainda tao jovem. A tranquilidade com que o a senhora lida com os problemas do dia- a-dia fazem-me repensar sobre a o processo de coordenação de um laboratório.

Nunca a vi com raiva (mesmo tendo motivos para isso), nunca a vi desesperada (mesmo estando sem empo), nunca vi tão gentil (mesmo tendo tantas coisas com que se preocupar). De uma de suas frases: Do whatever you want, the way you want, as soon as you do it! surgiu esse trabalho. Espero ter acertado a mao nos ingredientes. Tenho grande estima pela senhora senhora, o Lucas e o prof. Fernando. Eu plantei, apolo regou; mas o crescimento veio de Deus. coríntios, 6 Atenciosamente, Tiago 12 o próximo futuro.. Ao Dr. Alan Tunnacliffe, Eu ainda não conheço pessoalmente Dr. Alan Tunnacliffe, mas a julgar pelos inúmeros e-mails trocados ele me parece ser uma pessoa muito ágil, inteligente, sensata e pronto a ajudar.

Em especial gostaria de agradecê-lo pela maneira que me aceitou em seu laboratório, pela confiança em mim depositada, mesmo não me conhecendo. Espero retribuir tudo isso em uma interação científica com muitos frutos. Agrada-te do Senhor, e ele satisfará os desejos do teu coração. salmos, 37:4 Assunto: De: Data: Para: Prioridade: postdoctoral position “tiago campos pereira” Ter, Maio 3, 2005 2:26 pm a. tunnacliffe@biotech. cam. ac. uk Normal Versão para Impressão apresentamos uma plataforma e programas (da mesma) desenvolvidos durante este projeto e utilizados no desenho de todas as moléculas aqui descritas SiRNAS). No capítulo cinco relatamos a primeira utilização de siRNAs no tratamento da esquistossomose in vivo.

No capítulo seis investigamos a participação do gene mecp2 em diferentes tecidos no desencadeamento de um fenótipo clássico associado a mutações neste gene. No sétimo capítulo apresentamos um estudo de data mining sobre os genes envolvidos nos mecanismos de silenciamento gênico (PTGS/RNAi/co-suppressão) no banco de dados do Eucalyptus. Apesar de ser um estudo no reino vegetal, ele foi incluído nesta tese pois aborda de maneira sistemática esta via, apresenta sua abundância relativa e ode trazer aplicações da técnica em outras áreas além da médica. As produções cient[fico- acadêmicas produzidas ao longo do doutorado foram compiladas no capítulo oito. or fim, um adendum apresenta em forma detalhada procedimentos especiais deste projeto. Diante de um tema tão atual e amplo sinto a sensação de dever incompleto. A revisão apresentada a seguir não pôde contemplar em detalhes todos os aspectos envolvidos à RNAi pois exigiriam uma compilação extremamente longa, fugindo da realidade (e objetivo específico) desta tese. Os textos a seguir reunem os trabalhos realizados ao ongo dos trinta e dois meses (até então) deste projeto de doutorado financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo interferência por RNA (RNA) foi desenvolvida em 1998 por Andrew Fire, SiQun Xu, Mary K. Montgomery, Steven A. Kostas, Samuel E. Driver e Craig C.

Mello que chegaram a essa descoberta seguindo uma série de dados, resultados e publicações que apontavam para uma hipótese interessante sobre a ação de moléculas de RNA dupla fita (dsRNAs) na célula: promover silenciamento gênico. Provavelmente as primeiras observações referentes às implicações biológicas de sRNAs foram derivadas da natureza, séculos (ou até milênios atrás). Entre elas, a identificação de variedades de arroz com pouco conteúdo de proteínas (gluteínas – Surridge, 2003) e a surpreendente ação do v[rus PW sobre o v[rus PVX (supressão do silenciamento gênico; Ross, 1950). É possível ainda que algumas doenças genéticas relatadas há muito tempo sejam mediadas pela açao de dsRNAs.

O histórico mais recente aponta para 1983 como talvez a primeira demonstração molecular que um dsRNA seria capaz de levar ao silenciamento gênico (Schmidt et. al. , 1983; Schmidt, 2004). Artigo esse infelizmente ignorado por muito empo. Em 1990 um grupo de pesquisadores pretendendo produzir petúnias com uma cor púrpura mais intensa inseriu cópias adicionais do gene chalcone synthase, envolvido na produção de pigmentos de antocianina. O que observaram porém foi o paradoxal desenvolvimento de algumas flores variegadas ou totalmente brancas (figura 1). Este fenômeno foi denominado “co-su ressão e foi descrito por dois grupos distintos (van der colônias com uma cor laranja mais intensa.

Como anteriormente, um terço das colônias ficaram brancas. O fenômeno observado foi denominado “quelling’ (repressão Romano e Macino, 1992). Figura 1. Fenótipo associado à co-supressão. Em destaque, petúnia transgênica com elevado número de cópias do gene chalcone synthase. A ocorrência de co- supressão gerou o padrão de cor variegado (Gura, 2000). 18 Em 1995, Sue Guo e colaboradores apresentaram um trabalho analisando o gene par-1 de C. elegans utilizando a técnica de RNA antisenso. Relataram um detalhe intrigante em seus experimentos: tanto o RNA antisenso como senso (controle) levaram ao silenciamento do gene em estudo (Guo e Kemphues, 1995).

Por volta de 1996 já havia a hipótese que dsRNAs levassem de alguma forma ao ilenciamento gênico nas petúnias e fungos, idéia essa que soava como nonsense pois era dificil imaginar um mecanismo claro pelo qual isso pudesse acontecer. Contudo Fire e colaboradores acreditaram nessa hipótese e imaginaram que os experimentos de Guo eram paradoxais exatamente devido a uma contaminação das moléculas de RNA senso com antisenso, gerando dsRNAs que levaram ao silenciamento gênico. Em 1997 0 grupo de Fire testou a hipótese no verme C. elegans e a comprovou. Diante de tão grandes aplicações o depósito da patente adiou a publicação, que pode ser vista na edicao de 19 de f 8 da revista científica 0 DF 98