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Artigo A Coloraзгo de Gram e as Variaзхes na sua Execuзгo Valdionir da Rosa Freitas, Simone Ulrich Picoli Centro Universitбrio Feevale — Laboratуrio de Biomedicina Resumo A coloraзгo de Gram й um importante teste realizado nos laboratуrios de microbiologia, sendo um recurso auxiliar no diagnуstico de doenзas bacterianas.

A partir de um determinado perfil tintorial as bactйrias coram-se de roxo ou de rosa e conseqьentemente sгo classificadas como Gram-positivas ou Gram-negativas, envolve uma sйne de final de leitura da lв esfregaзo, sua fixaзг Nesta, o corante Cris OF8 view next page згo de Gram e chegar а etapa a confecзгo do propriamente. cйlulas, forma um complexo com o iodo (Lugol) e apуs a etapa diferencial, com бlcool-acetona, as cйlulas sгo contra-coradas com Fucsina de Grama Neste estudo avaliou-se a influкncia de variaзхes na referida coloraзгo considerando os tempos de exposiзгo aos corantes Cristal Violeta e a Fucsina de Gram e o emprego ou nгo de lavagens com бgua entre as etapas. Os resultados obtidos mostraram que as diferenзas nos procedimentos aplicados em cada tйcnica testada nгo alteraram o resultado quando comparados a lвminas padrгo.

Palavras-chave: Gram-positivo, Gram-negativo, bactйrias, coloraзгo de Gram Summary Gram staining and the variations in its execution The Gram staining is an important test carried through in microbiology laboratories, being an auxiliary resource in the diagnosis of determined staining profile the bacteria are stained purple or pink and consequently classified as Gram positive or Gram negative, respectively.

The Gram staining involves several procedures before the final reading stage: it begins with the deposition of the sample in the slide as well as its setting, passes for the Gram tain properly said with violet colouring matter and the formation of a complex with iodine (Lugol), followed by the distinguishing stage with alcohol-acetone and the background staining with Gram fuchsin. The influence of variations in the aforementioned staining was evaluated, considering the times of violet and fuchsin exposition as well as the use or not of the washings with water among steps.

The results obtained had shown that differences in the procedures applied in each tested technlque did not modify the result when compared with a standard design. Keyvvords: Gram positive, Gram negative, bacteria, Gram staining. Introduзгo modo adequado e demonstraзгo dos detalhes finos das suas estruturas. O advento da coloraзгo representa, em grande parte, fundamento dos principais avanзos produzidos em microbiologia clнnica e em outros campos da microscopia diagnуstica durante m geral, sгo necessбrias coloraзхes biolуgicas para a visualizaзгo de bactйrias de 124 Newsl_ab – ediзгo 82 – 2007 os ъltimos 100 anos (1).

A oloraзуes utilizadas em bacterioscуpico mais importante e mais utilizado atualmente na bacteriologia e sua finalidade й a classificaзгo de microrganismos om base em suas caracterнsticas tintoriais, tamanho, forma e arranjo celular (3, 4, 5). As bactйrias sгo classificadas basicamente em dois grandes grupos: Gram-positivas e Gram-negativas (6, 7, 8). No que diz respeito аs caracterнsticas tintoriais, as bactйrias Gram-positivas coram-se de roxo e as bactйrias Gram-negativas coram-se de rosa (9, 10).

A detecзгo de microrganismos na amostra й de suma importвncia, uma vez que pode indicar uma terapia antimicrobiana direcionada a um determinado grupo de patуgenos e, tambйm, a necessidade da realizaзгo de cultura om finalidade diagnуstica elou epidemiolуgica (11, 12). A tйcnica de coloraзгo de Gram geralmente respeita um protocolo de aзхes que a padroniza. Contudo, hб variantes nesse procedimento relacionadas aos tempos de execuзгo da coloraзгo e а utilizaзгo de lavagem com бgua em dadas etapas que podem ou nгo interferir na visualizaзгo das estruturas coradas.

Nesse sentido, este trabalho se propфs a verificar se estas pequenas variaзхes de tempo e lavagens a partir de protocolos especнficos refletem em alguma alteraзгo na interpretaзгo dos resultados da coloraзгo de Gram. Materiais e Mйtodos Inicialmente, foi realizada a documentaзгo da tйcnica da coloraзгo de Gram executada por diferentes laboratуrios, bem como a aquisiзгo de protocolos das bulas de diferentes kits de Gram e de protocolos da literatura vigente. Foram obtidos 13 protocolos de Gram dos quais 10 eram discrepantes.

As tйcnicas que apresentaram diferenзas entre si encontram-se resumidas na Tabela 1. Posteriorme 3 tйcnicas que apresentaram diferenзas entre si encontram-se resumidas na Tabela 1. Posteriormente, foi feita a inoculaзгo de cepas padronizadas (American Type Culture Colection – ATCC) de Escherichia coli ATCC 25922 e staphylococcus aureus ATCC 25923 em Caldo Soja Triptona (TSB). Estas foram incubadas em estufa, 370C, durante 24 horas. As cepas de referкncia foram utilizadas porque possuem um comportamento frente ao Gram que й Tabela 1 .

Levantamento de diferentes tйcnicas de coloraзгo de Gram- Cristal Violeta Lavagem H20/lugol# Lugol Lavagem H20 Бlcool-acetona Lavagem H20 Fucsina Gram Sim 1 min Sim * Sim 20 s Sim 1 min Sim *Sim 30 s Sirn 1 min Sim * Sim 1 min Nao 1 min Sim * Sim 30 s Nгo 1 min Nгo * Sim 30 s Nгo 1 min Nгo * Sim 30 s Nгo 1 min Sim * Sim 20 s Nгo 1 min Sim * Nгo 30 s Sim# min Nгo * Sim 30 s Sim# 1 min Sim * Sim 30 s Tйcnica 1 1 min Tйcnica2 Tйcnica 3 Tйcnica 4 Tйcnica 5 Tйcnica 6 1 min I min I min 30 s 1 min Tйcnica 7 Tйcnica 8 Tйcnica 9 Tйcnica 10 1 min 1 min 1 min 1 min *: gotejar бlcool-acetona atй o momento em que nao desprenda mais a cor violeta do esfregaзo. NewsLab – ediзгo 82 – 2007 125 Tabela 2. Controle de qualidade da coloraзгo pelo mйtodo de Gram Resultado Gram-negativo Gram-positivo Fonte: Oplustil et al. , 2000 (2).

Cepa Escherichia coli ATCC 25922 Staphylococcus aureus ATCC 25923 Resultado esperado Bacilos cor rosa Cocos cor roxo onsenso e com isso elas dificuldades como esfregaзos a partir destes caldos, utilizando-se pipetas automбticas de 10 PL a fim de dispensar uma quantidade aproximada de microrganismos em cada lвmina. Preparou-se um total de 40 lвminas (esfregaзos) para serem testadas frente aos IO protocolos obtidos. Para cada tйcnica foram confeccionadas duas lвminas do bacilo Gram-negativo (E. coli) e duas lвminas do coco Gram-positivo (S. aureus), fixadas atravйs do calor. A seguir, executou-se rigorosamente a tйcnica de coloraзгo de Gram descrita por cada um dos protocolos envolvidos neste estudo. Foi empregado unicamente um mesmo kit de coloraзгo para evitar variabilidades na concentraзгo de corantes encontradas em outras marcas.

O kit de coloraзгo de Gram foi manipulado sempre pelo mesmo tйcnico a fim de reduzir ao mбximo os interferentes. por fim, as lвminas foram analisadas microscopicamente em objetiva de imersгo, procedendo-se sempre no mesmo microscуpio, marca Nikon Eclipse E200. Foram lidas cegamente duas vezes as duplicatas, num total de 80 leituras. O registro das lвminas lidas foi computado e posteriormente rastreado o protocolo pertencente аquela lвmina bem como o tipo de cepa orrespondente. As lвminas coradas pelas diferentes tйcnicas de Gram obtidas nesse estudo foram comparadas аs lвminas controle: controle Gram positivo e Gram negativo (Tabela 2).

Se o grupo testado mostrasse alguma diferenзa na coloraзгo em relaзгo ao grupo controle seria considerado resultado alterado. No que concerne aos corantes, verificou-se o aspecto das soluзхes. Para minimizar a interferкncia devido а precipitaзгo de algum dos reagentes realizou-se a filtraзгo dos mesmos. Os corantes foram armazenados a tempera S reagentes realizou-se a filtraзгo dos mesmos. Os corantes foram rmazenados a temperatura ambiente, em local sem variaзхes bruscas de temperatura, a fim de evitar precipitaзгo, e ao abrigo da luz (12). Resultados Entre as lвminas coradas (n=40) segundo os protocolos obtidos, nenhuma apresentou alteraзгo tintorial em relaзгo аs lвminas controle (Tabela 3).

Os tempos utilizados para Cristal Violeta foram de 30 se 1 min, e em todas as tйcnicas aplicadas verificou se a cor roxa para cepa de Staphylococcus aureus, ATCC 25923, ou seja, todas as lвminas preparadas com estes cocos coraram- se adequadamente, sendo equivalentes а lвmina controle Gram positivo. Os tempos utilizados para a Fucsina de Gram foram de 20 s, 30 se 1 min, e em todas as tйcnicas aplicadas empregando a cepa Escherichia coli, ATCC 25922, verificou-se que os bacilos coraram-se de rosa, de forma similar а lвmina controle Gram negativo. O protocolo 2 ofereceu uma melhor visualizaзгo das caracterнsticas tintoriais das bactйrias Gram negativas. Tabela 3.

Resultados tintoriais das tйcnicas de Gram Resultado Alterado Nгo alterado NO Lвminas 0 40 126 Discussгo As variaзхes nos tempos dos reagentes Cristal Violeta e Fucsina de Gram nгo alteraram as caracterнsticas tintoriais das cepas adrхes, pois os cocos Gram positivos mostraram-se sempre corados em roxo, enquanto que os bacilos Gram negativos, em rosa. Nгo foi possivel avaliar o Lugol, pois o tempo empregado para este foi o mesmo em todas as tйcnicas (1 min). A descoloraзгo obedeceu sem re o mesmo procedimento, ou seja, a aplicaзгo do бlcool-aceto atй o momento em que a procedimento, ou seja, a aplicaзгo do бlcool-acetona perdurou atй o momento em que a cor violeta nгo fosse mais desprendida do esfregaзo. Devido a isso, nгo foi possнvel relacionar sua influкncia nesse estudo. O emprego ou nao de lavagem com бgua entre as etapas da co- oraзгo de Gram nгo interferiu na interpretaзгo dos resultados.

Assim, concluiu-se que nгo hб comprometimento dos resultados ao executar a tйcnica de coloraзгo de Gram aplicando modificaзхes nos tempos dos corantes e lavagens com бgua apresentados nesse estudo. A reprodutibilidade dos resultados foi equivalente jб que as variaзхes testadas nгo afetaram o resultado final. Uma contribuiзгo Importante desse estudo foi a demonstraзгo de que a aplicaзгo de determinado protocolo permitiu uma melhor visualizaзгo de bactйrias Gram- negativas. A partir da comparaзгo das tйcnicas de coloraзгo xecutadas foi possivel observar que na execuзгo do protocolo 2 a cepa Escherichia coli, ATCC 25922, corou-se de rosa claro diferentemente dos outros que se coraram de rosa mais escuro.

Segundo Oplustil (2), a colora- згo das bactйrias Gram-negativas de rosa escuro (no uso da Fucsina) ou de vermelho (no uso da Safranina) pode ser confundida com violeta, pois na escala de cores do espectro eletromagnйtico o vermelho/rosa escuro estб mais proximo do violeta do que do rosa claro. Nesse aspecto, a aplicabilidade prбtica do referido protocolo no dia-a-dia dos laboratуrios pode umentar a sensibilidade do teste na pesquisa deste grupo bacteriano em espйcimes cuja presunзгo seja de Bacilo Gram- negativo. Correspondкncias para: Simone Ulrich Picoli simonepi@terra. com. br AGRADECIMETOS А coordenaзao do Curso Simone Ulrich Picoli simonepi@terra. com. br AGRADECIMETOS А coordenaзгo do Curso de Biomedicina e ao Laboratуrio de Biomedicina do Centro Universitбrio Feevale pelo apoio no desenvolvimento deste estudo. Referкncias Bibliogrбficas 1.

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