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UFMG – Universidade Federal de Minas Gerais Instituto de Ciências Biológicas Ciêancia de Animais de Laboratório CONTROLE GENÉTICO DE ANIMAIS DE LABORTÓRlOAndré Figueiredo Clarice Otero Mauro Sérgio Silva Romulo Carleial Introdução para que a pesquisa biomédica, envolvendo animais de laboratório, seja eficaz no sentido de que os resultados de diferentes laboratórios possam ser avaliados e comparados, devem ser reconhecidos critérios para os cuidados com os animais, incluindo as definições do estado de genética saúde facilita destes e sua constituição genética a reprodutibilidade as experiências, é al 1 or12 to view nut*ge e ser utilizada sempre que possível.

As comparações entre resultados obtidos em trabalhos com diferentes tipos geneticamente definidos dentro da mesma espécie podem aumentar a importância de descobertas. Em certas espécies de mamíferos, especialmente o camundongo, e em menor grau o rato, porquinho da Índia e o hamster, a disponibilidade de uma grande variedade de unidades geneticamente definidas fornece aos pesquisadores um material experimental preciso. Outras espécies, em homozigotos, ou seja, elas não são puras. Linhagens comuns, ais como ratos Sprague-Dawley, Long-Evans e Wistar são semelhantes às “raças” de ovelhas ou cães, na medida em que diferem uma da outra nos genes que são fixados dentro do estoque genético.

O objetivo primário na manutenção de um estoque outbred é o de assegurar que este estoque mantenha- se constante em todas as suas características pelo máximo de gerações possível. Para o estoque se manter constante, este deve ser mantido como uma colônia fechada sem seleção atuante, de forma que ocorra menos de 1% de endogamia por geração. Na criação de animais agricolas, criadores utilizam uma pressão e seleção constante para melhorar características desejáveis, que é o oposto do que o cnador de animais de laboratório quer. Este, por sua vez, deseja evitar qualquer pressão de seleção. A fim de evitar endogamia ou a perda de alelos, as colônias de outbred não devem ser mantidas como colônias pequenas (menos de 30 pares reprodutores).

Os investigadores que criam linhagens outbred para fins experimentais (por exemplo, para estudar embriões, neonatos ou comportamento maternal), devem, periodicamente, voltar a uma colônia já estabelecida para reabastecer o estoque de reprodutores. ) Linhagens Inbred No uso geral, o termo “inbreeding” refere- se à criação de indivíduos aparentados, o que resulta em uma tendência no aumento da homozigose. Em genética de roedores, “inbred” tem um significado muito específico. Cada linhagem inbred é o resultado de 20 ou mais gerações consecutivas de único par de casais, irmão x irmã, em que todos os animais remontam a um par de reprodução único nas gerações 20 ou posterior .

Após 20 gerações, pode se esperar, em indivíduos de uma linhagem pura, 12 ou posterior . Após 20 gerações, pode se esperar, em indivíduos e uma linhagem pura, homozigose em 98,6 por cento dos seus loci. Como resultado, todos os indivíduos de uma linhagem pura são “isogênicos’i ou seja, geneticamente idênticos. Linhagens puras são de valor inestimável em estudos 2 envolvendo transferência de tecidos, tais como enxertos e estudos de tumores. Só pode haver um titular de uma determinada linhagem pura no mundo em qualquer momento. Animais derivados de uma linhagem pura, mas mantidos separadamente durante 10 gerações, são considerados uma sublinhagem. ) Os transgênicos Os animais transgênicos são animais (e eus descendentes) que foram criados pela introdução de DNA estranho nos seus cromossomos, durante o desenvolvimento embrionário precoce. Assim sendo, estes animals contêm genes transferidos. Transgênicos podem ser produzidos através de microinjecçáo pronuclear, transgênese mediada por retrovírus, trangênese mediada por células tronco embrionárias, o transplante nuclear (clonagem), a transferência de fragemenets cromossômicos, a transfecção de gametas e FIV, e injeção direta de ADN no músculo esquelético. Os animais transgênicos podem ser utilizados para estudar s genes individuais dentro do ambiente fisiológico do animal como um todo.

Eles também podem ser criados para estudar a oncogênese, doenças virais, doenças neurológicas, doenças cardiovasculares, e uma série de outros distúrbios imunológicos e metabólicos. Além disso ade do fenótipo PAGF 12 para produzir caros e raros produtos farmacêuticos humanos e veterinários e secretálos no leite ou sangue. Os animais podem também ser produzidos para resistir à patogenos especiTicos e crescer mals rapidamente e de forma mais eficiente. d) Os híbridos Fl Uma Fl híbrida é a primeira geração do ruzamento de duas linhagens inbred. Individuos híbridos Fl de um cruzamento específico, são geneticamente idênticos um do outro, mas são heterozigóticos em todos os alelos em que as linhagens parentais se diferiam.

Híbridos Fl não se cruzam, mas podem ser produzidos repetidamente pelo cruzamento das linhagens parentais puras. Híbridos Fl são mais vigorosos do que as linhagens puras. Eles irão desenvolver os tumores ou aceitar enxertos de pele uns dos outros e de qualquer linhagem parental. e) Linhagens Mutantes Um estoque mutante é qualquer linhagem outbred que carrega uma mutação mendeliana específica. O gene “nude” (“nu”) é um exemplo de uma mutação em camundongos. Quando uma mutação ocorre em uma estirpe pura ou pode ser colocado dentro de uma estirpe pura por técnicas de melhoramento adequados, as linhagens resultantes são conhecidas como “coisogênicos”, “‘Congênicos” ou “inbred segregados”. Estes serão discutidos abaixo. ) Linhagens Coisogênicas Um par de linhagens inbred que se diferem em apenas um locus gênico, resultante de uma mutação que ocorre dentro de uma linhagem de inbred já estabelecida, seguida da separação da linhagem mutante da normal, são ditos i’coisogenlcosi’ ) Linhagens Congênicas Quando uma mutação ocorre em uma linhagem que não é inbre róximo dos coisoeenicos 19 retrocruzamentos entre mutantes com uma linhagem inbred por diversas (de preferência 1 2) gerações. Tal linhagem segregante é conhecida como Congênica. g) Deriva Genética Deriva Genética é o nome que se dá para a fixação de alelos por aleatoriedade, portanto, não influenciada por seleção. É mais frequente em populações pequenas e por isso, deve-se manter as linhagens dos animais de laboratório com um N satisfatório, diminuindo a possibilidade de deriva. ) Gnotoblóticos A palavra gnotobiótico deriva das palavras gregas “gnotos” (conhecimento) e biota (“flora ou fauna”) significando portanto, “conhecimento da fauna ou da flora” Assim sendo, quando nos se referimos aos gnotobioticos, estamos nos referindo a um animal com uma flora microbiana conhecida. 2. Preocupações para aumentar a colônia – limitar a deriva genética – evitar a contaminação genética (mutação, cruzamentos errôneos) – seguir os procedimentos de acasalamento prescritos (geralmente BXS) – devem ser monitorados – manter a heterogeneidade genética (evitar o gargalo genético) ivre de vírus. Exemplos de linhagens BAI_g/c A linhagem BALB/c a resenta rodução de plasmocitomas em resposta a injeção de om consequente lipopolissacarídeo (LPS), ou seja, esta linhagem apresenta uma mutação no gene para o Toll Like Receptor 4 (TIr41ps).

Desta forma, esta linhagem é resistente à endotoxina. C5731/6J É a linhagem de camundongos inbred mais utilizada. É muito usada na produção de animais transgênicos. Esta linhagem apresenta animais de vida longa e com baixa susceptibilidade a tumores. Porém, possuem alta susceptibilidade à obesidade nduzida por Diabetes e Aterosclerose, alta incidência de microftalmia e outras anormalidades oculares. Assim como o BALB/C, é muito utilizada em pesquisas do sistema imune, porém sua resposta imune tem como perfil o padrão Thl. 6 Swiss Os camundongos Swiss originaram-se a nos USA partir de uma colônia de nove camundongos trazidos para Lausanne, Suíça, em 1 926 por Clara Lynch.

A estrutura genéticas das populaçóes / colônias de camundongos Swiss são comparáveis evolutivamente com população de uma ilha na qual a fixação alélica randômlca e aparentemente responsáveis por irrisórias erdas da variação genética e não por efeitos de consangüinidade ou gargalos evolutivos . Podem modelos a estudos com propósitos do mais variados, como o entendimento de doenças metabólicas, autoimunes, fixação de complemento, tumores de mama e pulmão. Fundo Genético O fundo genético ou pool genético traduz-se no conjunto completo de alelos únicos que podem ser encontrados no material genético de cada um dos organismos de uma determinada população ou linhagem, ou seja, é o conjunto de genes que define determinada população ou linhagem. O fundo genético influencia os fenótipos.

Mutações de introgressao em distintos fundos genéticos resultam em diferentes fenótipos; exemplificando: mutação sidade com o des PAGF 19 diferentes fenótipos; exemplificando: mutação que leva ? obesidade com o desenvolvimento de diabetes em um fundo C57BU6J resulta em obesidade com diabetes transiente, porém em um fundo C57BLKS/J, a mesma mutação resulta em obesidade com diabetes evidente. 7 O fundo genético afeta resultados. À medida que o número de linhagens e sublinhagens aumenta, a atenção ao fundo genético será cada vez mais importante. Caso contrário, os esultados poderão ser confusos ou não confiáveis. Embora uma justa quantidade de pesquisas confusas são provavelmente nunca reportadas, exemplos de estudos que as descrevem são indicadas a seguir: Wasted research effort because of a mix-up in the AUN substrains (Baney 1982. Irnrnunol TOday 3:210-14) Confounded results because of variablility in 129 substrains (Hogan et al. 1994. Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual, 2nd ed.

Cold Spring Harbor (NY); Threadgill et al. 1997) Dubious results because of C57BL substrain differences (Specht and Schoepfer 2001; Wotjak 2003) É fundamental escolher uidadosamente os controles e backgrounds para a pesquisa. Existem algumas fontes que auxiliam na escolha mais apropriada de controles e fundos genéticos para experimentos, tais quais: • • • • The Mouse Phenome Database The JAX @ Mice website The JAX @ Mice Database Technical SupportJackson Laboratory / Charles River Laboratory É importante salientar que genes em linkage podem diferir entre modelos experimentais e de controle, e assim, em alguns casos, é interessante testar alelos em diversos backgrounds.

Uma descrição detalhada do background genético no estudo valoriza a ublicação, bem como a comunica ao; uma vez que o uso de um background comum assee o do experimento. Moni a comunicação; uma vez que o uso de um background comum assegura a replicação do experimento. Monitoramento Genético A distância genética entre linhagens de animais de laboratório pode ser estmada por comparação dos perfis genéticos de estirpes que foram caracterizados por um conjunto de genes denominados marcadores genéticos. O estabelecimento de perfis de deformação genéticos também é necessário quando os genes marcadores são selecionados e usados para ontrole de qualidade genética das linhagens puras. Trabalhos iniciais de Controle Genético se baseavam na qualidade fenotipica dos animais de laboratório.

Padrão de cores, dados anatomorfométricos, análise de comportamento e comparação de dados rmcrobiológicos e bioquímicos levavam a um controle interno do que se chama de “Colônia Núcleo” (Nucleus colonies). Tais colônias de animais eram pequenas com rígido controle sanitário e cruzamentos monitorados segundo o tipo de linhagem _ inbreds ou outbreds. Ainda na década de 70 do século passado, técnicas como eletroforese de polimorfismos proteicos ram utilizadas para identificação de linhagens e controlar a qualidade de estirpes já estabelecidas no trabalho experimental. Entretanto nem sempre os perfis eletroforéticos eram comparáveis, o que tornava duvidosa a anállse. Tradicionalmente, um programa de controle de qualidade genética tem buscado técnicas que são facilmente reproduzíveis, simples de executar, e baratas.

Várias técnicas, tais como medições da mandíbula, preparações cromossômicas, ensaios imunológicos, e análise de marcadores bioqu[micos têm sido desenvolvidos para distinguir entre as estirpes e assegurar a sua pureza contínua enética. Entretanto com o advento de técnicas moleculares mais sofisticadas o controle genét contínua genética. Entretanto com o advento de técnicas moleculares mais sofisticadas o controle genético passou a ser mais rápido e rígido assegurando também a especificidade e sensibllidade da metodologla. Sabemos agora, a partir de estudos de polimorfismos de DNA, que a variação eletroforética de proteínas subestima o montante total da variação genética. Nos mamíferos, apenas cerca de 4% do código genético se refere diretamente para a sequência de aminoácidos das proteínas.

Como o código genético é edundante (um amnoácido particular pode ser especificada por mais do que uma sequência de DNA de três nucleótidos), há também “silenciosos” polimorfismos de nucleotideos dentro de regiões de codificação que nao alteram a sequência de aminoácidos. Identificação de marcadores bioquímicos para desenvolver perfis alélicos. Um procedimento utilizado em biotérios pode ser é o monitoramento bioquímico genético. Marcadores bioquimicos podem ser enzimas ou complexos protéicos. No caso dos marcadores de rato geralmente os tecidos amostrados são rins e do sangue. Os marcadores são olimórficos e localizados nos cromossomas de todo o genoma. para executar o controle, homogenatos de rim e de sangue são aplicados aos géis de acetato de celulose para eletroforese. Uma marcação histoquímica é então aplicada ao gel, e as bandas aparecem em locais em que as isoenzimas migraram.

Formas alélicas migram em taxas ligeiramente diferentes. Linhagens puras devem expressar apenas uma forma de cada marcador bioquímico. Contaminação genética é indicada se uma cepa pura expressa a forma errada de marcador ou é um heterozlgoto. É extremamente improvável que essas mudanças sejam devido ? eriva genética, ou seja, mutação ou heterozigosidade residu que essas mudanças sejam devido à deriva genética, ou seja, mutação ou heterozigosldade residual. Tais métodos muitas vezes são dispendiosos e de alto custo. Identificação de marcadores Isoenzmas, Eritrocitários e Imunológicos para desenvolver perfis alélicos.

Antigénios eritrocitário (Ea) são detectados utilizando um ensaio de hemaglutinação e são úteis em linhagens particulares que o genótipo tem forma idêntica para outros marcadores. O ensaio Eag é utilizado para distinguir entre animais C57BL/6J de C57BUIOJ, o qual o tipo tem forma idêntica ara 23 isoenzimas, são ambas de cor preta, e têm o mesmo complexo de histocompatibilidade principal (MHC), H2 b. No entanto CS7BL/6J Ea9a tem o antigénio e C57BU10J o antígeno eritrocitério é Ea9 b. 10 Isoenzimas são variantes da mesma proteína que exibem diferentes características ffsicas, tais como mobilidade eletroforética ou atividade enzimatica. Muitos isoenzimas são expressas em vários tecidos e podem ser identificadas a partir de plasma ou células sanguíneas lisadas.

Apesar de ser tecnicamente simples, facilmente reprodutível e barata algumas vezes, essa técnica nem sempre ode ser usada em ratos vivos: isto é, às vezes deve ser usada em matrizes aposentados, dificultando a identificação antecipada de contaminação genética. Exemplos de Isoenzimas testadas são Esterase 1 (Esle), Esterase 9 (Es9), ou Glicose isomerase fosfato 1 (Gpil). O complexo principal de histocompatibilidade (MHC) no camundongo está localizado no cromossoma 17. Este é um determinante importante da histocompatibllidade e é responsável pela aceitação ou rejeição do tecido após transplantes. O haplótipo H2 é um marcador imunológico útil e pode ser a única ferramenta para caracterização de linhgens