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Artigo A Coloração de Gram e as Variações na sua Execução Valdionir da Rosa Freitas, Simone Ulrich Picoli Centro Universitário Feevale — Laboratório de Biomedicina Resumo A coloração de Gram é um importante teste realizado nos laboratórios de microbiologia, sendo um recurso auxiliar no diagnóstico de doenças bacterianas.

A partir de um determinado perfil tintorial as bactérias coram-se de roxo ou de rosa e conseqüentemente são classificadas como Gram-positivas ou Gram-negativas, envolve uma séne de final de leitura da lâ esfregaço, sua fixaçã Nesta, o corante Cris OF8 view next page ção de Gram e chegar à etapa a confecção do propriamente. células, forma um complexo com o iodo (Lugol) e após a etapa diferencial, com álcool-acetona, as células são contra-coradas com Fucsina de Grama Neste estudo avaliou-se a influência de variações na referida coloração considerando os tempos de exposição aos corantes Cristal Violeta e a Fucsina de Gram e o emprego ou não de lavagens com água entre as etapas. Os resultados obtidos mostraram que as diferenças nos procedimentos aplicados em cada técnica testada não alteraram o resultado quando comparados a lâminas padrão.

Palavras-chave: Gram-positivo, Gram-negativo, bactérias, coloração de Gram Summary Gram staining and the variations in its execution The Gram staining is an important test carried through in microbiology laboratories, being an auxiliary resource in the diagnosis of determined staining profile the bacteria are stained purple or pink and consequently classified as Gram positive or Gram negative, respectively.

The Gram staining involves several procedures before the final reading stage: it begins with the deposition of the sample in the slide as well as its setting, passes for the Gram tain properly said with violet colouring matter and the formation of a complex with iodine (Lugol), followed by the distinguishing stage with alcohol-acetone and the background staining with Gram fuchsin. The influence of variations in the aforementioned staining was evaluated, considering the times of violet and fuchsin exposition as well as the use or not of the washings with water among steps.

The results obtained had shown that differences in the procedures applied in each tested technlque did not modify the result when compared with a standard design. Keyvvords: Gram positive, Gram negative, bacteria, Gram staining. Introdução modo adequado e demonstração dos detalhes finos das suas estruturas. O advento da coloração representa, em grande parte, fundamento dos principais avanços produzidos em microbiologia clínica e em outros campos da microscopia diagnóstica durante m geral, são necessárias colorações biológicas para a visualização de bactérias de 124 Newsl_ab – edição 82 – 2007 os últimos 100 anos (1).

A oloraçóes utilizadas em bacterioscópico mais importante e mais utilizado atualmente na bacteriologia e sua finalidade é a classificação de microrganismos om base em suas características tintoriais, tamanho, forma e arranjo celular (3, 4, 5). As bactérias são classificadas basicamente em dois grandes grupos: Gram-positivas e Gram-negativas (6, 7, 8). No que diz respeito às características tintoriais, as bactérias Gram-positivas coram-se de roxo e as bactérias Gram-negativas coram-se de rosa (9, 10).

A detecção de microrganismos na amostra é de suma importância, uma vez que pode indicar uma terapia antimicrobiana direcionada a um determinado grupo de patógenos e, também, a necessidade da realização de cultura om finalidade diagnóstica elou epidemiológica (11, 12). A técnica de coloração de Gram geralmente respeita um protocolo de ações que a padroniza. Contudo, há variantes nesse procedimento relacionadas aos tempos de execução da coloração e à utilização de lavagem com água em dadas etapas que podem ou não interferir na visualização das estruturas coradas.

Nesse sentido, este trabalho se propôs a verificar se estas pequenas variações de tempo e lavagens a partir de protocolos específicos refletem em alguma alteração na interpretação dos resultados da coloração de Gram. Materiais e Métodos Inicialmente, foi realizada a documentação da técnica da coloração de Gram executada por diferentes laboratórios, bem como a aquisição de protocolos das bulas de diferentes kits de Gram e de protocolos da literatura vigente. Foram obtidos 13 protocolos de Gram dos quais 10 eram discrepantes.

As técnicas que apresentaram diferenças entre si encontram-se resumidas na Tabela 1. Posteriorme 3 técnicas que apresentaram diferenças entre si encontram-se resumidas na Tabela 1. Posteriormente, foi feita a inoculação de cepas padronizadas (American Type Culture Colection – ATCC) de Escherichia coli ATCC 25922 e staphylococcus aureus ATCC 25923 em Caldo Soja Triptona (TSB). Estas foram incubadas em estufa, 370C, durante 24 horas. As cepas de referência foram utilizadas porque possuem um comportamento frente ao Gram que é Tabela 1 .

Levantamento de diferentes técnicas de coloração de Gram- Cristal Violeta Lavagem H20/lugol# Lugol Lavagem H20 Álcool-acetona Lavagem H20 Fucsina Gram Sim 1 min Sim * Sim 20 s Sim 1 min Sim *Sim 30 s Sirn 1 min Sim * Sim 1 min Nao 1 min Sim * Sim 30 s Não 1 min Não * Sim 30 s Não 1 min Não * Sim 30 s Não 1 min Sim * Sim 20 s Não 1 min Sim * Não 30 s Sim# min Não * Sim 30 s Sim# 1 min Sim * Sim 30 s Técnica 1 1 min Técnica2 Técnica 3 Técnica 4 Técnica 5 Técnica 6 1 min I min I min 30 s 1 min Técnica 7 Técnica 8 Técnica 9 Técnica 10 1 min 1 min 1 min 1 min *: gotejar álcool-acetona até o momento em que nao desprenda mais a cor violeta do esfregaço. NewsLab – edição 82 – 2007 125 Tabela 2. Controle de qualidade da coloração pelo método de Gram Resultado Gram-negativo Gram-positivo Fonte: Oplustil et al. , 2000 (2).

Cepa Escherichia coli ATCC 25922 Staphylococcus aureus ATCC 25923 Resultado esperado Bacilos cor rosa Cocos cor roxo onsenso e com isso elas dificuldades como esfregaços a partir destes caldos, utilizando-se pipetas automáticas de 10 PL a fim de dispensar uma quantidade aproximada de microrganismos em cada lâmina. Preparou-se um total de 40 lâminas (esfregaços) para serem testadas frente aos IO protocolos obtidos. Para cada técnica foram confeccionadas duas lâminas do bacilo Gram-negativo (E. coli) e duas lâminas do coco Gram-positivo (S. aureus), fixadas através do calor. A seguir, executou-se rigorosamente a técnica de coloração de Gram descrita por cada um dos protocolos envolvidos neste estudo. Foi empregado unicamente um mesmo kit de coloração para evitar variabilidades na concentração de corantes encontradas em outras marcas.

O kit de coloração de Gram foi manipulado sempre pelo mesmo técnico a fim de reduzir ao máximo os interferentes. por fim, as lâminas foram analisadas microscopicamente em objetiva de imersão, procedendo-se sempre no mesmo microscópio, marca Nikon Eclipse E200. Foram lidas cegamente duas vezes as duplicatas, num total de 80 leituras. O registro das lâminas lidas foi computado e posteriormente rastreado o protocolo pertencente àquela lâmina bem como o tipo de cepa orrespondente. As lâminas coradas pelas diferentes técnicas de Gram obtidas nesse estudo foram comparadas às lâminas controle: controle Gram positivo e Gram negativo (Tabela 2).

Se o grupo testado mostrasse alguma diferença na coloração em relação ao grupo controle seria considerado resultado alterado. No que concerne aos corantes, verificou-se o aspecto das soluções. Para minimizar a interferência devido à precipitação de algum dos reagentes realizou-se a filtração dos mesmos. Os corantes foram armazenados a tempera S reagentes realizou-se a filtração dos mesmos. Os corantes foram rmazenados a temperatura ambiente, em local sem variações bruscas de temperatura, a fim de evitar precipitação, e ao abrigo da luz (12). Resultados Entre as lâminas coradas (n=40) segundo os protocolos obtidos, nenhuma apresentou alteração tintorial em relação às lâminas controle (Tabela 3).

Os tempos utilizados para Cristal Violeta foram de 30 se 1 min, e em todas as técnicas aplicadas verificou se a cor roxa para cepa de Staphylococcus aureus, ATCC 25923, ou seja, todas as lâminas preparadas com estes cocos coraram- se adequadamente, sendo equivalentes à lâmina controle Gram positivo. Os tempos utilizados para a Fucsina de Gram foram de 20 s, 30 se 1 min, e em todas as técnicas aplicadas empregando a cepa Escherichia coli, ATCC 25922, verificou-se que os bacilos coraram-se de rosa, de forma similar à lâmina controle Gram negativo. O protocolo 2 ofereceu uma melhor visualização das características tintoriais das bactérias Gram negativas. Tabela 3.

Resultados tintoriais das técnicas de Gram Resultado Alterado Não alterado NO Lâminas 0 40 126 Discussão As variações nos tempos dos reagentes Cristal Violeta e Fucsina de Gram não alteraram as características tintoriais das cepas adrões, pois os cocos Gram positivos mostraram-se sempre corados em roxo, enquanto que os bacilos Gram negativos, em rosa. Não foi possivel avaliar o Lugol, pois o tempo empregado para este foi o mesmo em todas as técnicas (1 min). A descoloração obedeceu sem re o mesmo procedimento, ou seja, a aplicação do álcool-aceto até o momento em que a procedimento, ou seja, a aplicação do álcool-acetona perdurou até o momento em que a cor violeta não fosse mais desprendida do esfregaço. Devido a isso, não foi possível relacionar sua influência nesse estudo. O emprego ou nao de lavagem com água entre as etapas da co- oração de Gram não interferiu na interpretação dos resultados.

Assim, concluiu-se que não há comprometimento dos resultados ao executar a técnica de coloração de Gram aplicando modificações nos tempos dos corantes e lavagens com água apresentados nesse estudo. A reprodutibilidade dos resultados foi equivalente já que as variações testadas não afetaram o resultado final. Uma contribuição Importante desse estudo foi a demonstração de que a aplicação de determinado protocolo permitiu uma melhor visualização de bactérias Gram- negativas. A partir da comparação das técnicas de coloração xecutadas foi possivel observar que na execução do protocolo 2 a cepa Escherichia coli, ATCC 25922, corou-se de rosa claro diferentemente dos outros que se coraram de rosa mais escuro.

Segundo Oplustil (2), a colora- ção das bactérias Gram-negativas de rosa escuro (no uso da Fucsina) ou de vermelho (no uso da Safranina) pode ser confundida com violeta, pois na escala de cores do espectro eletromagnético o vermelho/rosa escuro está mais proximo do violeta do que do rosa claro. Nesse aspecto, a aplicabilidade prática do referido protocolo no dia-a-dia dos laboratórios pode umentar a sensibilidade do teste na pesquisa deste grupo bacteriano em espécimes cuja presunção seja de Bacilo Gram- negativo. Correspondências para: Simone Ulrich Picoli simonepi@terra. com. br AGRADECIMETOS À coordenaçao do Curso Simone Ulrich Picoli simonepi@terra. com. br AGRADECIMETOS À coordenação do Curso de Biomedicina e ao Laboratório de Biomedicina do Centro Universitário Feevale pelo apoio no desenvolvimento deste estudo. Referências Bibliográficas 1.

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