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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ CENTRO DE CIÊNCIAS EXA AS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA Análise comparativa entre oito métodos de esterificação na determinação quantitativa de ácidos graxos em óleo vegetal Tese apresentada por Maria Cristina Milinsk ao Programa de Pós- Graduação em Química do Departamento de Química do Centro de Ciências Exatas da Universidade Estadual de Maringá como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutor em Ciências.

MARINGÁ, NOVEMBR Dados Internacionai (Biblioteca Central – to view nut*ge icaçao (CI P) M644a Milinsk, Maria Cristina An lise comparativa entre oito métodos de esterificação na determinação quantitativa de ácidos graxos em óleo vegetal / Maria Cristina Milinsk. – Maringá : [s. n. ], 2007. xii, 92 f. : il. figs. , tabs. Orientador : Prof. Dr. Nilson Evelázio de Souza. Tese (doutorado) – Universidade Estadual de Maringá. Programa de PósGraduação em Química, 2007. 1. Esterificação. 2. Ácidos graxos – Qu(mlca. 3. Ésteres metllicos de ácidos graxos. 4. Cromatografia gasosa. 5. ?cidos graxos – Quantificação. Universidade Estadual de Maringá. Programa de Pós-Graduação em Química. l. Título. CDD 21 . ed. 547. 24 UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGA CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA Universidade Estadual de Maringá como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Ciências. Orientador: prof. Dr. Nilson Evelázio de Souza MARINGÁ, NOVEMBRO/2007 Crom Alimentos Grupo de Pesquisa Dedico este trabalho a alguém ainda tão pequenino, mas que já é a razão de toda a minha vida e o maior incentivo para finalizar mais esta jornada, ao Marcos Vinícius.

Os sujeitos de qualidades extraordinárias dependem do tempo m que vivemos. Nem todos tiveram a época que mereciam e muitos que tiveram não souberam aproveita-la. Alguns merecem tempos melhores, pois nem tudo o que é bom triunfa sempre. Todas as colsas têm suas estações e até os valores estão sujeitos à moda. Mas o sábio tem uma vantagem: é eterno. Se este não é seu século, muitos outros serão. Não existe ninguém que não possa ser mestre de alguém em alguma coisa, e não há quem exceda quem excede. O sábio estima a todos, pois reconhece o que há de bom em cada um e sabe como custa fazer algo bem feito.

Baltazar Gracián AGRADECIMENTOS ? Deus, razão de todas as coisas e a luz que nos faz vencer diante dos obstáculos. Aos pais, Cândido in memorian) e Ariana, meus exemplos de vida e razão aqui. Aos meus irmãos PAGF Virgílio Visentainer, pelos conhecimentos compartilhados. A Profa. Dra. Helena Shizuko Nakatani pela amizade e auxllio durante todo o trabalho. Ao Prof. Dr. Willian Ferreira da Costa pela amizade e sugestões no trabalho. Ao prof. Dr. Makoto Matsushita e a Profa. Dra. Sandra pela amizade e pelo empréstimo de livros. Ao técnico Dirceu Batista pela amizade, convivência e auxilio na operação do cromatógrafo.

Ao técnico Ariovaldo pela amizade e incentivo diante das dificuldades. Aos técnicos André e Airton pela paciência e prestatividade diante de tantos empréstimos de materiais e reagentes. Aos amigos que já concluíram esta etapa: Roseli, Flávia, Walber, Clayton e Adriana pela amizade, oportunidade do convívio e pelo conhecimento compartilhado neste período. As amizades que se iniciaram no convívio do laboratório que sem dúvida sentirei saudades: Ailey, Juliana, Elton, Ricardo, Paula, Rúbia, Vanessa, Ivane e Julliana. Ea todos cujos nomes não foram citados, mas que contribuíram para ue este trabalho fosse realizado.

RESUMO Na análise de ácidos graxos por cromatografia gasosa é necessário a aplicação de procedimentos de esterificação, onde os ácidos graxos são convertidos em compostos mais voláteis, como os ésteres metílicos de ácidos graxos (EMAG). Os métodos de esterificação normalmente são subdivididos em duas categorias: catálise ácida e catálise básica, sendo os reagentes mais usados na catálise ácida o ácido clorídrico (HCI), ácido sulfúrico (H2S04) e trifluoreto de boro (BF3) em metanol, e na catálise básica, hidróxido de sódio (NaOH) ou potássio (KOH) m metanol e metóxido de sódio (NaOCH3) em metanol.

Devido à possibilidade de obter diferentes resultados para concentração de ácidos graxos para a mesma amostr PAGF 3 OF possibilidade de obter diferentes resultados para concentração de ácidos graxos para a mesma amostra, em função do método de esterificação utilizado, o objetivo deste trabalho foi verificar a eficiência de 8 diferentes métodos de esterificação envolvendo catálise ácida e básica na determinação quantitativa de EMAG em cinco óleos vegetais (soja, canola, linhaça, azeite de oliva e de dendê). Os métodos analisados foram de catálise ácida descritos por: Metcalfe et al. 1966 (MET); gannon et al. , 1 982a (BAN); Joseph e Ackman, 1992 (JAC); Hartman e Lago, 1973 (HLA); lham et al. , 1982 (JHA) e de catálise básica, ISO 5509, 1978 (ISO); Bannon et al. , 1982b (BBA) e schuchardt e Lopes, 1988 (SLO). os resultados mostraram a eficiência dos métodos de esterificação para os principais ácidos graxos saturados (Cl e Cl 8:0) presentes nos óleos vegetais analisados. Os métodos MET e BAN apresentaram resultados semelhantes e inferiores quando comparado com os outros métodos para os ésteres metílicos nsaturados possivelmente devido ao tempo de aquecimento empregado na esterificação.

O método SLO também apresentou valores de concentração menor para os ésteres metílicos insaturados, isto pode ter ocorrido por impedimento estérico devido ao tamanho da molécula do catalisador e as distorções na cadeia dos ácidos graxos insaturados e pelo tempo de aquecimento empregado no método. Entre os principais ácidos graxos insaturados presentes nos óleos analisados, os métodos JHA e HLA apresentaram valores de concentração inferiores para o oleato de metila (C 18:1 n-g) e linoleato de metila (C18:2n-6), espectivamente.

No entanto, deve ser considerado que estes métodos utilizam reagentes de baixo custo, menor toxicidade e de maior disponibilidade quando c estes métodos utilizam reagentes de baixo custo, menor toxicidade e de maior disponibilidade quando comparado aos métodos que empregam BF3. Os métodos mais eficientes para a esterificação dos ácidos graxos insaturados nos óleos analisados foram: JAC, ISO e BBA. Entretanto, o reagente BF3 em metanol usado no método JAC é extremamente tóxico, apresenta custo elevado e tempo de vida útil limitado.

Assim, quando o óleo a er analisado apresentar baixo índice de acidez os métodos de catállse básica ISO que utillza NaOH em metanol e BBA (NaOCH3 em metanol) podem ser usados ao invés do método JAC por usarem reagentes de menor custo e toxicidade. Os resultados obtidos mostraram que o método a ser escolhido para análise de ácidos graxos depende também da composição do óleo a ser estudado. Palavras-chave: Esterificação, Ésteres metllicos de ácidos graxos, cromatografia gasosa.

ABSTRACT To perform the analysis of fatty acids through gas chromatography, it is necessary to apply esterification procedures n which fatty acids are converted into more volatile compounds, such as the fatty acids methyl esters (FAME). Esterification methods are usually subdivided into two categories: acid catalysis and base catalysis. In acid catalysis, the reagents mostly used are the hydrochloric acid (HCI), the sulfuric acid (H2S04) and boron trifluoride (BF3) in methanol; whereas the ones used in base catalysis are the sodium hydroxide NaOH) or potassium (KOH) in methanol, and sodium OCH3) in methanol.

PAGF s OF function of the esterification method used, the efficiency of 8 different esterification methods that involve acid and base atalysis, in the quantitative determination of FAME, was verified in five vegetable Oils (soybean, canola, flaxseed, Olive and palm Oil). The methods of acid catalysis analyzed were described by Metcalfe et al. , 1966 (MET); Bannon et al. , 1 982a (BAN); Joseph and Ackman, 1992 (JAC); Hartman and Lago, 1973 (HLA); whereas the base catalysis methods analyzed were lham et al. , 1982 ORA); ISO 5509, 1978 (ISO); aannon et al. , 1982b (BBA) and Schuchardt and Lopes, 1988 (SLO).

Results showed the efficiency of the esterification methods for the main saturated fatty acids (Cl and C 18:0) that were present in the vegetable Oils analyzed. MET and BAN methods presented close results, though inferior, when compared to other methods for the unsaturated fatty acids, possibly due to the heating up period used in esterification. The SLO method has also presented inferior concentration values for the unsaturated fatty acids. That may have occurred due to the molecule size of the catalytic unit and by distortions in the Chain of unsaturated fatty acids, as well as by the heating time used in the method.

Among the main unsaturated fatty acids, which were present in the Oils analyzed, JHA and HLA methods presented inferior concentration values or methy oleate and methyl linoleate, respectively. However, it should be taken into consideration that those methods use reagents with low cost, lower toxicity but larger availability, if compared to methods that use BF3. The most efficient methods for esterification of unsaturated fatty acids in the oils analyzed were JAC, ISO and BBA. iii Nevertheless, the BF3 reagent fatty acids in the oils analyzed were JAC, ISO and BBA. ii Nevertheless, the BF3 reagent in methanol, used in JAC method, is extremely toxic, besides presenting high cost and limited useful life. Thus, when the Oil to be analyzed presents low acidity, the ethod of base catalysis ISO, which uses NaOH in methanol and BBA (NaOCH3 in methanol) can be used to substitute JAC method, once they use reagents presenting lower toxicity and lower cost. Results obtained showed that the method to be chosen for performing the analysis offatty acids depend also on the composition of the Oil to be studied.

Key-words: Esterlfication, Fatty Acids Methyl Esters; Gas Chromatography iv LISTA DE ABREVIATURAS EMAG – ésteres metilicos de ácidos graxos CG – cromatografia gasosa CCD — cromatografia de camada delgada CLAE – cromatografia liquida de alta eficiência TG – triacilgliceróis AG ácidos graxos AGS – ácidos graxos saturados AGI – ácidos graxos insaturados AGMI – ácidos graxos monoinsaturados AGPI – ácidos graxos polinsaturados AGL – ácidos graxos livres HCI – ácido clorídrico H2S04 – ácido sulfúrico gF3 – trifluoreto de boro NaOH – hidróxido de sódio KOH – hidróxido de potássio NaOCH3 – metóxido de sódio MeOH ou CH30H – metanol MET – método descrito por Metcalfe et al. , 1966 BAN – método descrito por Bannon et al. , 1982a JAC – método descrito por Joseph e Ackman, 1992 HCA- método descrito por Hartman e Lago, 1973 JHA – método descrito por Jham et al. 1982 ISO – método descrito pela ISO 5509, 1978 BBA – método desc ito por Bannon et al. , 19825 SLO – método descrito por Schuchardt e Lopes, 1988 PAGF 7 Figura 1.

Molécula de um triacilgllcerol…………. Estrutura de alguns ácidos graxos………. saponificação………………….. ISO pelo método . Figura 2. Figura 3. Mecanlsmo de reação de transesterificação de um triacilglicerol com metanol na presença de hidróxido de sódio. Figura 4. Reação de hidrólise: Figura 5. Utilizaçao de metóxido de sódio como catalisador. Figura 6. Mecanismo de reação de transesterificação de m triacilglicerol com metanol na presença de catalisador Figura 7. Mecanismo de reação de esterificação de um ácido graxo com metanol na presença de catalisador ácldo…. Mecanismo de reação de hidrólise por Figura 8. Figura 9.

Cromatograma representativo dos EMAG presentes no azeite de dendê obtido pelo método JAC… . Figura 10. Cromatograma representativo dos EMAG presentes no azeite de oliva obtido pelo método ISO…… Figura 1 1 . Cromatograma representativo dos EMAG presentes no óleo de soja obtido pelo método ISO… Figura 12. Cromatograma representativo dos EMAG resentes no óleo de canola obtido pelo método Figura 13. Cromatograma representativo dos EMAG presentes no óleo de linhaça obtido . Figura 14. PAGF 8 OF 14. Concentração de palmitato de metila (Cl 6:0) obtida por diferentes métodos de esterificação para os diversos óleos vegetais analisados…. Figura 15.

Concentração de estearato de metila (Cl 8:0) obtida por diferentes métodos de esterificação para os diversos óleos vegetais Figura 16. Concentração de oleato de metila (Cl 8:1 n-9) obtida por diferentes métodos de esterificação para os diversos óleos vegetais analisados. 4 161717 18 19 19 39 42 45 48 51 52 53 54 posicional de ácidos graxos na molécula de glicerol em alguns óleos vegetais……. Tabela 3. Métodos de esterificação selecionados… Tabela 4. índice de acldez determinado nos óleos vegetais 35 36 5 25 5 analisados. • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Tabela 5. Valores de fator resposta em relação ao tricosanoato de metila… Tabela 6.

Concentração dos ésteres metílicos de ácidos graxos (mg/g de óleo) obtidos do azeite de dendê empregando diferentes métodos de esterificação……. Tabela 7. Concentração dos ésteres metílicos de ácldos graxos (mg/g de óleo) obtidos do azeite de oliva empregando diferentes métodos de esterificação. Tabela 8. Concentração dos ésteres metílicos de ácidos graxos (mg/g de óleo) obtidos do óleo de soja empregando diferentes métodos de . Tabela 9. Concentração dos ésteres metílicos de ácidos graxos (mg/g de óleo) obtidos do óleo de canola empregando diferentes métodos de esterificação……….. Tabela 10. Concentração dos ésteres metílicos de ácidos graxos (mg/g de óleo) obtidos do óleo de linhaça empregando diferentes métodos de